张永振团队:新型冠状病毒更有效地感染人类

张永振团队:新型冠状病毒更有效地感染人类

时间:2020-02-14 16:54 作者:admin 点击:
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·这篇论文作者是复旦大学公共卫生学院张永振教授,论文提交到《自然》的时间是1月7日,最终在2月3日发表。研究团队从1位患者身上提取出了病毒的完整基因组,该团队是最早公布病毒基因组的团队。

·研究证实该病毒与SARS同属于冠状病毒,但是一种新型的冠状病毒。

·新型冠状病毒有效地利用人ACE2作为细胞进入受体,从而使得其更容易感染人类。

·通过基因组序列对比表明,新型冠状病毒与感染人类的SARS病毒或蝙蝠身上的类SARS病毒之间发生了基因重组,但还不能推定是基因重组促进了新型冠状病毒的诞生。

这篇论文是上海公共卫生临床中心、复旦大学公共卫生学院张永振教授带领团队研究所写,文章提交给Nature杂志的时间是1月7日,过了接近一个月才正式发布。张教授是第一位公布该病毒序列的科研工作者,1月10日便已公布序列。

SARS和Zika等新型传染病对公共卫生构成了重大威胁。尽管进行了广泛的研究,但是如何,何时以及何地出现新疾病仍然是相当不确定。最近在中国湖北省武汉市报告了一种严重的呼吸系统疾病。自第一位患者于2019年12月12日住院以来,截至2020年1月25日,已报告至少1,975例病例。流行病学调查表明,此次爆发与武汉的海鲜市场有关。我们研究了一名在市场上工作的患者,该患者于2019年12月26日入住武汉市中心医院,患有严重的呼吸系统综合症,包括发烧,头晕和咳嗽。支气管肺泡灌洗液样本的宏基因组RNA测序鉴定出了冠状病毒科的新型RNA病毒,在此称为WH-Human-1冠状病毒。对完整病毒基因组(29,903个核苷酸)的系统进化分析表明,该病毒与一组SARS样冠状病毒(Betacoronavirus属,Sarbecovirus亚属)最相似(89.1%核苷酸相似性)。这次疫情突出表明,病毒从动物身上溢出的能力正在引起人类严重疾病。

为了调查与该疾病相关的可能病原,我们收集了支气管肺泡灌洗液(BALF)并进行了深转录组测序。 临床标本在上海公共卫生临床中心的生物安全3级实验室中处理。通过基因对比测试,2019-nCoV与蝙蝠冠状病毒bat-SL-CoVZC45的亲缘关系最密切。

为了更好地了解WHCV感染人类的潜力,将其刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)与SARS-CoV和蝙蝠SARS样CoV中的受体结合结构域进行了比较。结果表明2019-nCoV可以有效地利用人ACE2作为细胞进入受体,从而潜在地促进人与人之间的传播。

同时基因检测也说明2019-nCoV存在基因重组,但没有证据表明重组促进了WHCV的出现。

SARS和Zika等新型传染病对公共卫生构成了重大威胁。尽管进行了广泛的研究,但是如何,何时以及何地出现新疾病仍然是相当不确定。最近在中国湖北省武汉市报告了一种严重的呼吸系统疾病。自第一位患者于2019年12月12日住院以来,截至2020年1月25日,已报告至少1,975例病例。流行病学调查表明,此次爆发与武汉的海鲜市场有关。我们研究了一名在市场上工作的患者,该患者于2019年12月26日入住武汉市中心医院,患有严重的呼吸系统综合症,包括发烧,头晕和咳嗽。支气管肺泡灌洗液样本的宏基因组RNA测序鉴定出了冠状病毒科的新型RNA病毒,在此称为WH-Human-1冠状病毒。对完整病毒基因组(29,903个核苷酸)的系统进化分析表明,该病毒与一组SARS样冠状病毒(Betacoronavirus属,Sarbecovirus亚属)最相似(89.1%核苷酸相似性)。这次疫情突出表明,病毒从动物身上溢出的能力正在引起人类严重疾病。

研究的患者是一名41岁的男性,无肝炎,结核病或糖尿病病史。他于病发六天后即2019年12月26日在武汉市中心医院就诊并住院。患者在就诊一周后报告发烧,胸闷,咳嗽,疼痛和无力(表1)。心血管,腹部和神经系统检查均正常。观察到轻度的淋巴细胞减少症(每立方毫米少于900个细胞),但在全血细胞计数(CBC)测试中,白细胞和血小板计数正常。在血液化学测试中,观察到C反应蛋白(CRP,血液41.4 mg / L,参考范围0-6 mg / L)升高,并且天冬氨酸转氨酶,乳酸脱氢酶和肌酸激酶的水平略有升高。通过动脉血气(ABG)测试,该患者患有轻度低氧血症,氧水平为67mmHg。在入院的第一天(发病后的第6天),胸部X线照片异常,并伴有空域阴影,如毛玻璃片混浊,两个肺出现局灶性实变和斑块状实变(扩展数据图1)。胸部计算机断层扫描(CT)扫描显示双侧局灶性实变,肺叶实变和片状实变,特别是在下肺部。胸部X光片显示入院后第5天(发病后第11天)双侧弥漫性斑块状和模糊阴影。初步的病原学调查通过商业病原体抗原检测试剂盒排除了流感病毒,肺炎衣原体和肺炎支原体的存在,并通过PCR进行了确认。其他常见的呼吸道病原体,包括腺病毒,也通过qPCR检测为阴性(扩展数据图2)。尽管进行了抗生素,抗病毒和糖皮质激素的联合治疗,但患者扔表现出呼吸衰竭,并接受了高流量无创供氧。治疗三天后患者的病情没有改善,他被送进了重症监护室(ICU)。该患者入院6天后被转移到武汉的另一家医院接受进一步治疗。

表1:

扩展数据图1:

扩展数据图2

武汉市疾病预防控制中心(CDC)的流行病学调查显示,该患者在当地的室内海鲜市场工作。 值得注意的是,除了鱼类和贝类外,在暴发开始之前,市场上还出售各种活的野生动物,包括刺猬,獾,蛇和鸟类(斑鸠),以及动物尸体和动物肉。 没有蝙蝠出售。 尽管患者可能与市场上的野生动物接触过,但他回忆说没有接触活禽。

为了调查与该疾病相关的可能病原,我们收集了支气管肺泡灌洗液(BALF)并进行了深转录组测序。 临床标本在上海公共卫生临床中心的生物安全3级实验室中处理。 从200μlBAL液中提取总RNA,并为双末端(150 bp)构建一个元转录组文库,用于成对末端(150 bp)测序,用于成对末端(150 bp)测序,如前所述。总共,我们产生了56,565,928个序列读数,这些序列读数从头开始组装并筛选潜在的病原体。在Megahit8组装的384,096个重叠群中,最长的(30,474个核苷酸[nt])具有很高的丰度,并且与蝙蝠SARS样冠状病毒分离株bat-SL-CoVZC45(GenBank登录号MG772933)密切相关——先前在中国采样, nt同一性为89.1%(补充表1和2)。分别通过RT PCR9和5'/ 3'RACE试剂盒(TaKaRa)确定并确认了这种新型病毒的基因组序列及其末端。将该新病毒命名为WH-Hunman-1型冠状病毒(WHCV)(也称为“2019-nCoV”),其整个基因组序列(29,903 nt)已传至GenBank登录号MN908947。针对WHCV的完整基因组重新映射RNA-seq数据获得了123,613个读段的组装,提供了99.99%的基因组覆盖率,平均深度为6.04X(范围:0.01X -78.84X)(扩展数据图3)。通过定量PCR(qPCR)估计BALF样品中的病毒载量为3.95×108拷贝/ mL(扩展数据图4)。

扩展数据图3

扩展数据图4

WHCV的病毒基因组组织的特征是针对Beta冠状病毒属的两个代表性成员的序列比对:人类起源的冠状病毒(SARS-CoV Tor2,AY274119)和蝙蝠起源的冠状病毒(Bat-SL-CoVZC45,MG772933)。

基于该序列比对和ORF预测,对WHCV的非翻译区(UTR)和开放阅读框(ORF)进行了定位。 WHCV病毒基因组类似于这两种冠状病毒(图1和补充表3),基因顺序为5'-复制酶ORF1ab-S-包膜(E)-膜(M)-N-3'。 WHCV具有典型的beta冠状病毒的5'和3'末端序列,在5'末端有265nt,在3'末端有229nt。 预测的WHCV复制酶ORF1ab基因长度为21,291 nt,包含16个预测的非结构蛋白(补充表4),其次是(至少)13个下游ORF。此外,WHCV与nsp1中的SARS-CoV共享一个高度保守的域(LLRKNGNKG:氨基酸122130)。 WHCV的S,ORF3a,E,M和N基因的预测长度分别为3,822、828、228、669和1,260 nt。除了由Sarbecovirus亚型的所有成员共享的这些ORF区域之外,WHCV与SARSCoV相似之处在于,它携带一个位于M和N的ORF基因之间的ORF8预测基因(长度为366 nt)。WHCV的ORF功能是根据已知的冠状病毒预测的,并在补充表5中给出。以类似于SARS CoV Tor2的方式,可以很容易地在ORF的5'端上游识别出一个前导转录调控序列(TRS)和九个假定的主体TRS,并且假定的保守TRS核心序列以两种形式出现-ACGAAC或CUAAAC(补充表6)。

图1

为了确定WHCV与先前鉴定的冠状病毒之间的进化关系,我们基于整个基因组序列的核苷酸序列,非结构蛋白基因ORF1a和1b以及S,E,M和N编码的主要结构蛋白,估算了系统发生树(图2和扩展数据图5)。在所有系统发育中,WHCV都与Sarbecovirus亚类的成员聚集在一起,包括引起2002-2003年全球SARS大流行的SARS-CoV,以及从蝙蝠中取样的许多SARS样冠状病毒样本。但是,根据所使用的基因,WHCV改变了在Sarbecovirus亚属内的拓扑位置,这暗示了这组病毒中过去的重组历史(图2和扩展数据图5)。具体而言,在S基因树中(扩展数据,图5),WHCV与蝙蝠冠状病毒bat-SL-CoVZC45的亲缘关系最密切,氨基酸(aa)同一性82.3%(与SARS-CoV的氨基酸同一性77.2%;补充表3),而在ORF1b系统发生中,WHCV下降至轮状病毒亚属内的基础位置(图2)。在估计复制酶多蛋白pp1ab中保守结构域的系统树中,也观察到了这种拓扑划分,可能反映了蝙蝠sarbecovirus病毒之间的重组(扩展数据图6)。

扩展数据图5

图2

扩展数据图6

为了更好地了解WHCV感染人类的潜力,将其刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)与SARS-CoV和蝙蝠SARS样CoV中的受体结合结构域进行了比较。WHCV的RBD序列与SARS-CoV的RBD序列更为相近(73.8%-74.9%氨基酸同一性),与SAS样CoV也很相近,包括RB4874,Rs7327和Rs4231(75.9%-76.9%氨基酸同一性),这些都可以使用人ACE2受体进入细胞(补充表7)。此外,WHCV RBD仅比SARS-CoV RBD长一个氨基酸(扩展数据图7a)。相反,与SARS-CoVs相比,包括不能使用人ACE2的Rp3株的其他蝙蝠SARS样CoVs在473-477和460-472位具有氨基酸缺失(扩展数据图7a)。先前确定的与人ACE2复合的SARS-CoV RBD的晶体结构(PDB 2AJF)显示,区域473-477和460-472与人ACE2直接相互作用,因此在确定物种特异性中可能很重要(扩展数据图7b)。我们使用SWISS-MODEL服务器通过蛋白质同源性建模预测了WHCV,Rs4874和Rp3 RBD结构域的三维蛋白质结构,并将它们与SARS-CoV RBD结构域的晶体结构(PDB 2GHV)进行了比较(扩展数据图7c- F)。与序列比对一致,WHCV和Rs4874 RBD结构域的预测蛋白质结构与SARS-CoV的蛋白质结构密切相关,并且与Rp3预测的RBD结构域的蛋白质结构不同。此外,WHCV S蛋白的N末端与SARS-CoV的N末端更相似,而非其他可以与唾液酸结合的人冠状病毒(HKU1和OC43,扩展数据图8))。 WHCV和SARS-CoV RBD结构域之间的氨基酸序列和预测的蛋白质结构表明,WHCV可以有效地利用人ACE2作为细胞进入受体,从而潜在地促进人与人之间的传播。

扩展数据图7

扩展数据图8

为了进一步表征轮状病毒的进化史中的推定重组事件,使用了重组检测程序v4(RDP4),分析了WHCV和四种代表性冠状病毒的全基因组序列-蝙蝠SARS样CoV Rp3,CoVZC45,CoVZXC21和SARS-CoV Tor2。尽管相似性图表明WHCV和SARS CoV或SARS样CoV之间可能发生重组事件(扩展数据图9),但没有显着证据表明整个基因组都发生重组。但是,在WHCV、SARS CoV和蝙蝠SARS样CoV(WIV1和RsSHC014)的S基因中检测到一些过去重组的证据(p

图3